真菌基因组DNA提取
及Southern杂交
华中农业大学
应用真菌研究所
内容
一、组织材料的准备
二、DNA提取
三、DNA质量检测
四、Southern杂交
一、组织材料的准备
1.菌丝培养
2.菌丝收集、保存
3.子实体（原基、菇蕾）
1.菌丝培养
培养方式
•液体培养（CYM，PDA）
!不提倡使用麦芽培养基（含糖量高，色素）
•固体平板培养（玻璃纸）
菌丝平皿活化
培养时间（5~15天）
!具体时间由菌株长速决定，原则是菌丝幼嫩，无色素产生。
!单核体
2.菌丝收集
洗掉培养基
去掉接种块
菌丝块底部幼嫩菌丝要彻底洗净
滤纸吸水、压干
!时间不要太长，更不要过夜
•氧化变褐
•污染
液氮速冻，-70℃保存
3.子实体（原基、菇蕾）
新鲜的
切片
液氮速冻，-70℃保存
二、DNA提取
1.DNA的理化性质
2.DNA提取方法和原理
3.DNA提取步骤及注意事项
4.DNA的溶解及保存
1.DNA的理化性质
I.天然状态的DNA（Deoxyribonucleicacid）是以脱氧核糖
核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。
II.DNA纯品为白色纤维状固体，溶于水，不溶于乙醇、乙
醚和氯仿等有机溶剂，其钠盐在水中的溶解度较大。
III.DNA所含有的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，使核酸有紫
外吸收特性，在240-290nm之间有强吸收峰，最大吸收
峰在260nm处。
IV.DNA的等电点pI为4～4.5。
V.DNA的双螺旋结构实际上僵直且具有刚性，受剪切力的
作用，易断裂成碎片。这也是目前难以获得完整大分子
DNA的原因之一。
2.DNA提取方法和原理
I.实验室常用提取方法及试剂
SDS法
100mMNaCl,100mMTris-HCl,50mMEDTA,1%SDS
CTAB法
100mMTris-HCl,20mMEDTA,1.4MNaCl,2%CTAB,2%PVP,
2%β-ME
苯酚：氯仿：异戊醇（phenol：chloroform:
isoamylalcohol，PCI，V:V:V=25:24:1）
氯仿：异戊醇（CA，V:V=24:1）
10%CTAB
3MNaAc（pH5.2）/3MNaCl
无水乙醇
70%乙醇
II.DNA提取原理
要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再
把蛋白除去，再除去细胞中的糖，RNA及无机离子
等，从中分离DNA。
①SDS（Sodiumdodecylsulfate，十二烷基磺酸钠）是一种
去污剂，可溶解细胞膜上的脂质与蛋白。在高温（55～
65℃）条件下裂解细胞，解聚细胞中的核蛋白，与蛋白
质结合成为复合物，使蛋白质变性而沉淀下来，释放出
核酸。
②CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三
甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜。它能与
核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7MNaCl）是可溶的，通
过离心就可将复合物同蛋白、多糖类物质分开；当降低溶液
盐的浓度到一定程度（0.3MNaCl）时复合物从溶液中沉淀，
CTAB能溶解于乙醇中，再加入乙醇使核酸沉淀。
③
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