细胞工程-原代及传代细胞培养

流式细胞分离仪是当代细胞分离的高效技术。特别在大量细胞分离时，具有良好的效果和实际应用价值。（二）依据贴壁速度的细胞纯化

原代细胞培养初期或细胞传代时均可依据细胞贴壁速度来分离不同类型的细胞。如原代培养的巨噬细胞群中往往含有淋巴细胞、中性粒细胞、成纤维细胞等，根据大多数巨噬细胞有极易附着于玻璃表面的特性，先将细胞群置于玻璃培养容器中数小时，此后再用培养液或PBS冲洗去除尚未附着的其它细胞，借此可得到较纯的巨噬细胞。

（三）依据对消化酶敏感性的细胞纯化

细胞类型不同，对同一种消化酶的敏感性不同，培养的贴壁细胞在消化时敏感者首先从瓶壁上脱落下来，借此可以将不同类型的细胞分离开来。如上皮细胞与成纤维细胞共存时，加入EDTA-胰蛋白酶，成纤维细胞首先变圆，从瓶壁上脱落下来，而上皮型细胞仍然贴在瓶壁上。此时将细胞悬液取出另行培养，就可将两者分开（图4-22）。图4-22用EDTA-胰蛋白酶消化单层贴壁细胞，成纤维细胞首先变圆，从瓶壁上脱落下来，而上皮型细胞仍然贴在瓶壁上。习题

10.简述原代细胞培养时的细胞分离方法及注意事项。

11.培养细胞常用的纯化方法。（二）单细胞分离

1.机械分离无菌操作得到的组织块用平衡盐溶液冲洗，置小瓶中加少许平衡盐溶液，用眼科剪剪碎（一般直径为1mm3左右），自然沉降后再做进一步消化。

较柔软的组织（如脑组织、淋巴组织）可以通过在滤网上挤压、研磨的方法直接制成细胞悬液；脾脏内的淋巴细胞还可以通过脾内注射平衡盐溶液的方法将其冲洗出来。这种方法得到的细胞单细胞数量较多，不必进一步消化处理。为了得到较纯的目的细胞（如血液中的白细胞）可通过密度梯度离心的方法进行分离。即根据细胞比重不同，使各类细胞相互分开。常用的细胞分离液有淋巴细胞分离液、Percoll、Ficoll等各种规格的市售产品。

2.消化酶分离比较致密的组织，在剪碎的小块中加入比组织块总量多30倍左右的胰蛋白酶液，用恒温水浴或置入37℃温箱中消化。消化时间依组织块大小和组织的硬度而定。通常胰蛋白酶、EDTA或二者的混合液可用于消化大部分不同来源的组织。个别组织如动物的皮肤组织，细胞间连接紧密，细胞间质中胶原纤维含量较多，短时间难以消化，可选取对该组织更加敏感的酶（如胶原酶等）消化。对难以消化的组织，有时采用延长消化时间的方法得到更多的游离单细胞，但消化酶作用时间过长有可能损伤细胞，应适当加以控制。

（三）细胞计数

细胞悬液制备后，需要计算悬液中所含细胞数量，根据计算结果用培养液稀释细胞到一定浓度（一般为105细胞／毫升）,方可分装到培养瓶、皿中进行培养。单位体积内细胞数量过高或过低都不利于原代细胞成活与生长。另一方面，只有健康的细胞才有活力，接种后才能够生长和增殖，所以在接种前应先进行细胞计数和细胞活率检测，以活细胞数量为准来确定接种细胞的浓度。台盼蓝（TrypanBlue）是活细胞计数最常用染料，具有对细胞毒性较小，活细胞不着色的特点。藉此在显微镜下可将活细胞与死细胞加以区别，并计算活细胞在群体细胞中的百分比（细胞活率）。单位体积内的细胞数可用血球计数板计算，亦可用电子计数器进行。

（四）接种培养

通过细胞计数测知悬液中细胞密度后，可根据实验需要进一步调整细胞悬液的密度，然后向培养容器中接种。细胞接种数量随实验目的、血清含量和细胞生物性状而定；一般接种量在1～l0×105细胞／毫升范围之内。实验周期短，希望细胞增殖较快时，接种量可加大。原代细胞培养，接种量过大和过小都不能取得最佳效果，甚至导致培养失败。

在普通恒温箱中培养细胞，培养容器需要密闭，以免CO2逸出而造成培养液pH上升。一但发现这种情况（溶液变红）要及时调整pH。在CO2或三气培养箱中进行培养，瓶盖一定要松开，以便换气。培养过程中每天要检查细胞贴壁情况、生长与增殖情况，并每隔3～5天更换一次培养液。细胞铺满瓶壁时要及时进行传代。

二、组织块原代培养

组织块培养法是原代细胞培养常用的基本方法，适用于各种组织的原代培养，特别是难以消化的组织。组织块培养操作程序简单，培养前不经过酶液处理，细胞损伤较小。但由于培养过程中细胞移动受到较大限制，完成原代培养所需的时间较长。

组织块培养可按下列程序操作（图4-18）1.组织块修整将取材得到的组织块用平衡盐溶液反复清洗，然后置于灭菌的平皿或小瓶中用眼科剪剪碎，小块的直径一般应低于1mm。

2.贴壁与培养用眼科镊夹取小组织块，将其摆放在培养皿或培养瓶的底面上，每个小块之间的距离约为0.5～1cm。摆放时不可携带过多的培养液，摆放完毕后静置一段时间，使组织块与瓶壁贴牢后添加培养液；也可将摆放好组织块的培养瓶底部向上置培养箱中培养2～3小时后再添加培养液。添加培养液时一定要缓慢，不可将组织块

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